施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法的建立

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.022

畜牧兽医学报 ›› 2015, Vol. 46 ›› Issue (1): 174-178.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2015.01.022

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施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法的建立

张永强，吴晓东，赵永刚，王志亮^*

（中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032）

收稿日期:2014-05-26 出版日期:2015-01-23 发布日期:2015-01-23
通讯作者: 王志亮（1966-），研究员，博士生导师，E-mail：zlwang111@163.com
作者简介:张永强（1977- ），男，山东邹平人，博士，助理研究员，主要从事病毒分子生物学研究，Tel：0532-87839922，E-mail:zhangyq_l@163.com
基金资助:
现代农业产业技术体系（奶牛）（NYCYTX-0305）

Establishment of Detection and Identification Method for Schmallenberg Virus by Pyrosequencing

ZHANG Yong-qiang，WU Xiao-dong，ZHAO Yong-gang，WANG Zhi-liang^*

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032,China）

Received:2014-05-26 Online:2015-01-23 Published:2015-01-23

摘要/Abstract

摘要：

拟建立施马伦贝格病毒（SBV）S基因焦磷酸测序检测方法，用于施马伦贝格病毒病的快速检测和确诊。通过对公开发表的SBV S基因序列与布尼病毒科其他11种病毒S基因进行比对，找出不同病毒变异区域集中且变异区域两侧保守的序列片段，基因合成，体外转录，作为基因扩增模板。在特异性变异序列两端的保守区域设计扩增引物，进行RT-PCR扩增。在保守区域设计双向测序引物，对RT-PCR产物进行双向焦磷酸测序。通过比对测序结果，确定是否为SBV核酸序列；优化条件，确定检测方法的敏感性、特异性和重复性，建立SBV S基因焦磷酸测序检测方法。结果：建立的施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法扩增基因片段长度为166 bp；敏感性为可检测到104个拷贝；每一条测序引物可准确测出50 bp左右核酸序列，双向测序可准确测出100 bp左右核酸序列，具有较好特异性，完全满足施马伦贝格病毒病确诊要求；重复测序3次，均能准确测出100 bp左右核酸序列。本研究建立的施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法，可用于施马伦贝格病毒病的检测和确诊，整个检测过程可在1 d内完成，大大缩短了确诊时间。

Abstract:

The aim of the present study was to establish a pyrosequencing method targeting S gene for detection and identification of schmallenberg virus (SBV).In alignment with published more than 10 viruses S gene sequences which belong to Bunyaviridae and are highly homogenous with SBV.Adaptive sequence for pyrosequencing was synthesized and in vitro transcripted to cRNA as the RT-PCR templates.After RT-PCR reaction，the products were detected with forward and reverse pyrosequencing and identified by genomic alignment.Results showed that the RT-PCR products were 166 bp.The sensitivity of the method that the minimum copies could be detected was 104 copies.The specificity that sequencing length by pyrosequencing was around 100 bp which could make a definite diagnosis for SBV.The results presented here demonstrate that the detection and identification method for SBV by pyrosequencing was established.The method can be used in fast diagnosis for SBV.

中图分类号:

S852.659.5

张永强，吴晓东，赵永刚，王志亮. 施马伦贝格病毒病焦磷酸测序检测方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2015, 46(1): 174-178.

ZHANG Yong-qiang，WU Xiao-dong，ZHAO Yong-gang，WANG Zhi-liang. Establishment of Detection and Identification Method for Schmallenberg Virus by Pyrosequencing[J]. ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA, 2015, 46(1): 174-178.

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参考文献

［1］WALTER C T，BARR J N.Recent advances in the molecular and cellular biology of bunyaviruses ［J］.J Gen Virol，2011，92(Pt 11):2467-2484.
［2］TARLINTON R，DALY J，DUNHAM S，et al.The challenge of Schmallenberg virus emergence in Europe ［J］.Vet J，2012，194(1):10-18.
［3］DE REGGE N，DEBLAUWE I，DE DEKEN R，et al.Detection of Schmallenberg virus in different Culicoides spp.by real-time RT-PCR ［J］.Transbound Emerg Dis，2012，59(6):471-475.
［4］HERDER V，WOHLSEIN P，PETERS M，et al.Salient lesions in domestic ruminants infected with the emerging so-called Schmallenberg virus in Germany ［J］. Vet Pathol，2012，49(4):588-591.
［5］DE REGGE N，VAN DEN BERG T，GEORGES L，et al.Diagnosis of Schmallenberg virus infection in malformed lambs and calves and first indications for virus clearance in the fetus ［J］.Vet Microbiol，2013，162(2-4):595-600.
［6］ELAHI E，RONAGHI M.Pyrosequencing：a tool for DNA sequencing analysis ［J］.Methods Mol Biol，2004，255：211-219.
［7］ELBERS A R，MEISWINKEL R，VAN WEEZEP E，et al.Schmallenberg virus in Culicoides spp.biting midges，the Netherlands，2011［J］.Emerg Infect Dis，2013，19(1):106-109.
［8］MANSFIELD K L，LA ROCCA S A，KHATRI M，et al.Detection of Schmallenberg virus serum neutralising antibodies［J］.J Virol Methods，2013，188(1-2)：139-144.
［9］LOEFFEN W，QUAK S，DE BOER-LUIJTZE E，et al.Development of a virus neutralisation test to detect antibodies against Schmallenberg virus and serological results in suspect and infected herds ［J/OL］.Acta Vet Scand，2012，54：44.［2014-12-10］.http://www.actavetscand.com/content/54//44.
［10］GARIGLIANY M M，BAYROU C，KLEIJNEN D，et al.Schmallenberg virus：a new Shamonda/Sathuperi-like virus on the rise in Europe［J］.Antiviral Res，2012，95(2)：82-87.
［11］HECHINGER S，WERNIKE K，BEER M.Evaluating the protective efficacy of a trivalent vaccine containing Akabane virus，Aino virus and Chuzan virus against Schmallenberg virus infection ［J/OL］.Vet Res，2013，44：114.［2014-12-10］.http://www.veterinaryresearch.org/content/44/1/114.
［12］OIE.OIE Immediate notification report(Schmallenberg-Virus).［EB/OL］ http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?reportid=11514，2014-03-26.
［13］CHENGULA A A，KASANGA C J，MDEGELA R H，et al.Molecular detection of Rift Valley fever virus in serum samples from selected areas of Tanzania［J］.Trop Anim Health Prod，2014，46(4)：629-634.
［14］ STRAM Y，KUZNETZOVA L，GUINI M，et al.Detection and quantitation of akabane and aino viruses by multiplex real-time reverse-transcriptase PCR［J］.J Virol Methods，2004，116(2)：147-154.

[1]	孟令宅, 陈春丽, 于蒙蒙, 王占新, 王素艳, 刘鹏, 何塔娜, 郭茹, 陈运通, 刘长军, 祁小乐, 吴志强, 高玉龙. B亚型禽偏肺病毒对黄羽肉鸡致病性分析及其灭活疫苗免疫效果评价[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(12): 5154-5161.
[2]	蒋盛强, 胡靖, 陈红英. H1N1亚型流感病毒感染A549细胞的环状RNA表达分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(11): 4724-4734.
[3]	张傲, 谭斌, 刘可欣, 刘佳利, 张淑琴. 一株H1N1亚型猪流感病毒全基因组特征分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(11): 4866-4871.
[4]	何辰香, 高闪电, 田占成, 独军政, 王锦明, 关贵全, 殷宏. 基于G_NS蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断ELISA方法的建立[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(10): 4320-4326.
[5]	常益铭, 汤承, 岳华. 牦牛源牛呼吸道合胞体病毒的分子流行病学调查[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(5): 2030-2041.
[6]	方源, 侯巧弟, 项超辉, 赵红奕, 齐雪峰. IFITM3对小反刍兽疫病毒在山羊子宫内膜上皮细胞中增殖的调控效应[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(5): 2200-2207.
[7]	李舜, 李桂珍, 原耀贤, 李康健, 马春全, 李守军, 黄良宗, 马骏. PA-X基因的长度变化对H3N2犬流感病毒复制能力和致病性的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(1): 272-280.
[8]	崔明仙, 王星博, 黄彦铭, 卞希一, 冯梦珂, 颜焰, 董伟仁, 周继勇. 3株H3N2亚型禽流感病毒的基因组特征与演化分析[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(11): 4116-4122.
[9]	于蒙蒙, 包媛玲, 王素艳, 辛子琪, 刘鹏, 冯笑艳, 孟令宅, 郭茹, 张艳萍, 刘长军, 祁小乐, 李俊平, 王笑梅, 高玉龙. B亚型禽偏肺病毒的分离鉴定及致病性研究[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(10): 3540-3549.
[10]	周勇, 李知新, 鲁宏伟, 孙燕, 李甜, 杜凡姝, 蒲娟. 我国H5和H7N9亚型高致病性禽流感的监测及疫情暴发分析[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(9): 3093-3106.
[11]	潘春容, 邓瑞雪, 胡林杰, 朱学亮, 孙跃峰, 王桂荣, 蒙学莲. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对小反刍兽疫病毒复制的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(7): 2307-2316.
[12]	陈子轩, 张楠, 胡群, 全柯吉, 秦涛, 陈素娟, 彭大新, 刘秀梵. 我国H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白145和153位抗原位点变异分析[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(4): 1165-1172.
[13]	段志强, 谢玲玲, 陈佳琪, 唐宏, 王燕碧, 赵采芹, 赵佳福. 新城疫病毒M蛋白与宿主蛋白相互作用的研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(1): 32-42.
[14]	严雅瑶, 顾敏, 刘秀梵. HA蛋白位点变异影响H7N9亚型流感病毒特性的研究进展[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(8): 2093-2106.
[15]	蒋梅, 陈武, 翟俊琼, 卜婉迪, 谢逸伦, 刘灿彬, 单芬, 罗满林. 小熊猫源犬瘟热病毒株H、F基因的克隆及序列分析[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(6): 1670-1676.

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